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發(fā)布時(shí)間：2019/7/16 6:31:05 閱讀次數：1831
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Western Blot，通常我們在日常交流中說(shuō)的就是簡(jiǎn)稱(chēng)“WB”，中文名稱(chēng)是“蛋白印跡”或“免疫印跡”，其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠電泳后，按分子量大小順序在分離膠中分離開(kāi)來(lái)，通過(guò)轉膜可將膠上蛋白質(zhì)轉移到固相載體（通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜）表面，然后加入一抗去特異性結合膜上蛋白質(zhì)，再加入酶或者熒光素標記的二抗，二抗與一抗結合反應后，通過(guò)底物顯色、化學(xué)發(fā)光等方法檢測目的蛋白。Western Blot實(shí)驗一般用來(lái)判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低。
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| 轉膜具體情況 | 要點(diǎn)和建議 |
| 大分子量蛋白 | 1）大的蛋白傾向于在膠里沉淀，阻礙轉移。在轉膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現象； 2）甲醇傾向于從蛋白上移除SDS，因此把甲醇濃度降到10%甚至更少，有助于減少上述沉淀現象， 適用于大分子量蛋白轉膜； 3）用4℃濕轉過(guò)夜代替半干法轉膜。 |
| 小分子量蛋白 | 1）SDS阻礙蛋白和膜的結合，但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉膜的蛋白很小，可以考慮去掉 緩沖液里的SDS； 2）保持甲醇濃度在20%； 3）對于非常小的蛋白，不要用半干法。 |
| 膜的方向確定 | 轉移后剪角做標記，分清正反面；用鉛筆做記號或電泳時(shí)Marker上成非對稱(chēng)的。 |
| 轉膜后背景高 | 選擇NC膜；另外，雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結合而導致高背景；可以換成NC膜以減 少背景。 |
| 轉膜時(shí)污染 | 避免手指觸碰膜，可以用鑷子來(lái)取膜。手指上的油脂和蛋白質(zhì)會(huì )阻礙有效的轉膜，也會(huì )弄臟雜交。 |
| 濾紙的大小 | 確保濾紙和膜的大小與膠一致。當使用半干法轉膜時(shí)，過(guò)多的部分會(huì )阻礙電流穿過(guò)膜。 |
解決方案4：增加抗體濃度，注意抗體儲存條件（避免反復凍融）；
抗體的保存和使用：
1 收到抗體后按要求離心后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝盒保存；
2 對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃
2.1 分裝的量以一次實(shí)驗用為好，最好不能少于10ul每份，因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能受到蒸發(fā)及管壁吸附的影響；
2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)；
3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒(méi)有影響的。
任何時(shí)候，絕對避免反復凍融。
原因分析5：抗體孵育時(shí)間不足；
解決方案5：建議一抗4度孵育過(guò)夜；相對于2小時(shí)孵育，一抗4度過(guò)夜孵育會(huì )顯著(zhù)增加抗體的結合。
 | 原因分析1：條帶向上彎曲（︶ 條帶呈笑臉狀）：凝膠制備不均勻，中間冷卻不好； 解決方案1： 分離膠配好后用水壓線(xiàn)，保證水平，配膠緩沖液現用現配，混合均勻后制膠。 |
 | 原因分析2：條帶向下彎曲（︵ 條帶呈皺眉狀）：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡； 解決方案2：制膠架裝配好后，用水檢查是否有空隙再灌膠。 |
 | 原因分析3：條帶顯示不均勻，中空：可能凝固太快導致聚合不均勻； 解決方案3：使用合適的促凝劑，制膠液混合好后及時(shí)灌膠 |
 | 原因分析1：加樣過(guò)量； 解決方案1：降低上樣量，推薦每孔上樣20-30ug。 |  原因分析4：電極不平衡，加樣位置偏斜； 解決方案4：電泳槽水平放置，配膠時(shí)盡量小心，確保每個(gè)加樣孔完好無(wú)損。 |
 | 原因分析2：蛋白降解； 解決方案2：使用蛋白酶抑制劑。 | |
 | 原因分析3: 樣品溶解不好； 解決方案3：樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。 |  原因分析5：樣品中含有不可溶顆粒； 解決方案5：緩沖液配好后過(guò)濾除菌，樣品裂解保證可溶性 |
更多實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題留待下次討論，敬請期待。
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